Молекулалық генетикалық зерттеу әдісі

ДНК құрылымында нұсқаларын зерттеу және анықтау үшін молекулярлық-генетикалық әдіс қолданылады. хромосома, генінің немесе аллель осы аймақты зерттейді әр ДНК облысы, үшін, әдістері әр түрлі. әрбір молекулярлық-генетикалық әдісін негізінде жатқан РНК және ДНК кейбір немесе басқа манипуляциялар қамтиды. Барлық осы әдістері зор күрделілігі сипатталады, лабораториялық жағдайда жүзеге асырылуы мүмкін емес, және жоғары білікті қызметкерлер штаты болуы тиіс. Бұл жұмыс бірнеше кезеңмен жүзеге асырылады.

кезеңдері

өндірілетін болады Біріншіден, РНК немесе ДНК үлгілері. Мұнда, молекулярлық-генетикалық әдіс іс жүзінде кез келген материалға қолданылуы мүмкін: қан тамшысы, лейкоциттер, фибробласттар мәдениет, шырышты, тіпті шаш (қырып) - ДНК кез келген үлгідегі алуға болады. Ол кез келген генетикалық әдістер және олардың әр түрлі нұсқалары молекулалық және ұзақ оқшауланған ДНК мұздатылған сақталады пайдалануға жарамды. ол (организмнің тірі қатысуынсыз пробиркалар) пробиркалар полимеразды тізбекті реакцияны қамтамасыз етуге көмектеседі ретінде екінші кезеңі, ДНК қажетті үзінділер (күшейту) жинақталуына арналған. Нәтижесінде, таңдалған ДНҚ фрагменті осы тізбекті реакция арқылы көбейтеді, кейде ДНҚ сомасы ұлғайса сөзбе миллиондаған.

молекулярлық-генетикалық зерттеу әдістері үшінші қадам болжануда ДНК шектеу (осы үзіндісі, слезотечение немесе кесу) көбейтіледі. а полиакриламида немесе агарозном геле бойынша электрофорез арқылы жүзеге шектеу. ДНК фрагменті зерделеу Бұл молекулалық-генетикалық әдіс әркім гель белгілі бір орын алуға мүмкіндік береді. Осыдан кейін, гель онда ол люминесценция бөліктерін сақтауға болады, ультракүлгін жарық бар ДНК қабілетті байланысу бромидпен этиди, сәулелендіру қарастырылады. Молекулалық-генетикалық диагностика әдістері әр түрлі және көптеген бар, бірақ алғашқы екі қадамдар барлық ортақ болып табылады. Бірақ ДНК фрагменттері анықтау мақсатында, гель түсті, және басқа да көптеген қолданыстағы әдістері болады.

түрлері

микобактерия анықтау үшін ең тікелей және кең таралған әдістері жоғарыда молекулярлық-генетикалық ДНК оқыту әдісін қамтуы мүмкін. Оның мәні тәртіппен қоздырғыштардың ерекше учаскелерін ДНК сканерлеу тізбегі материал анықтау үшін, бұл болып табылады. Молекулалық генетикалық диагностикалық әдістер әлі туберкулез сияқты ауруларды тану туралы неғұрлым тиімді жолын жоқ. полимеразды тізбекті реакция (ПТР) пайдалана отырып, сіз бастапқы ДНК, миллион есе көшірмелер санын арттыруға мүмкіндік береді, яғни, күшейту болады, және ол нәтижелерді көрсету сенімді бола аламыз. Сезімталдық деңгейі өте жоғары болып табылады - бұл әдістің басты артықшылығы болып табылады астам тоқсан бес пайыз.

бұл жағдайда редакциялық үлгісі нақты Олигонуклеотидті реттілігі жүз алты есеге дейін өсті көрсетеді, өйткені өнімділігі бірнеше данасын тиімділігі бойынша зерттеулер молекулалық-генетикалық әдістері қалған сөзбе, екі есе. Тыныс алу жүйесінің туберкулез Тіпті мәдениет диагнозы айтарлықтай өз сезімталдығы төмендетіңіз. Қазіргі заманғы медицина туберкулез диагностикасының молекулярлық-генетикалық әдістері негізделген неге осы. А сипатталған әдіс басқа жолы әлдеқайда қиын екенін анықтау, жоғары антигендік өзгермелілігі қоздырғыштарын айналысатын, әсіресе тиімді болып табылады - арнайы талап қоректік медианы және ұзақ уақыт өсіру. Биохимиялық және молекулярлы-генетикалық әдістері қорытындысы туралы өте әр түрлі әсер.

Туберкулез диагностикасы

Ең кең таралған ауру барлық төрт түрлері үшін нақты болып табылатын ДНК реттілігін пайдаланып туберкулездің Маршалл ПТР диагностика. Осы мақсатқа жету үшін жиі осы элементтер жоғары қоныс аударатын түр Mycobacterium туберкулез және әрқашан геномының осы бірнеше көшірмелерін сипаттайтын ретінде тізбегі, элементтері (IS-986,-6110 АЖ) IS анықтау праймерлер пайдаланыңыз. Сондай-ақ, ДНҚ экстракциясын кез келген басқа қолайлы әдіспен таза мәдениеттер мен клиникалық (науқастардың қақырық) жүзеге асырылуы мүмкін. Мысалы лизис буферлік тасымалдаушы ДНК ретінде гуанидин thiocyanate кремнезем негізделген пайдаланылады, онда Boom әдісі. жыл сайын артып кедей бактериологиялық өзгеше науқастар саны, сондықтан клиникалық тәжірибеде ұйымның мүлдем басқа деңгейге құрды: ДНК зерттеу молекулалық-генетикалық әдіс диагностикалау маңызды рөл атқарып келеді.

Алайда, біз ол кемшіліктер жоқ емес екенін мойындау керек. ПТР әдісі көбінесе жалған-оң нәтижелерін үлкен санын әкеледі, және себебі техникалық қателер, сонымен қатар әдісін өзі ерекшеліктері ғана емес пайдалану болып табылады. Сонымен қатар, анықталған микобактериялардың, өміршеңдігін анықтау үшін диагностика осы әдісін пайдалана отырып, ол жай ғана мүмкін емес болып табылады. Бірақ бұл кемшілігі ең маңызды болып табылады. ПТР диагностика молекулярлық-генетикалық әдістері микобактериялық ДНК ластану қаупін әкеп соғады. тек қана қатты арналған ПТР зертханалар үшін, олар үш бөлек үй-жайларды талап осы себеппен сертификаттау талаптары. ПТР технология тиісті жабдықтар мен жоғары білікті қызметкерлер қолдануды талап етеді, қазіргі заманғы және өте күрделі болып табылады.

bacterioscopy

талдау нәтижелері диагноз басқа деректер салыстырғанда тиіс кезде: клиникалық емтихан, рентгенография, жағынды микроскопия, өсімдік және нақты емдеу тіпті жауап өте маңызды болып табылады. Осыған сериясы, ПТР зерттеулер тек бір компоненттерін болып табылады. ерте диагностикалау қоздырушы Detect қарапайым және жылдам әдістері болуы мүмкін - бактериологиялық.

(Флуорохромами бояғыш) жеңіл (Ziehl-Neelsen бояғыш) микроскоп және флуоресценттік бар пайдаланылады. артықшылығы қорытындысы жағынды жылдамдығы. Бірақ оның кемшілігі әділ төмен сезімталдық байланысты шектеулі сыйымдылығы саналады. Алайда, бұл әдіс ең үнемді және туберкулез науқастарды анықтау үшін негіз ретінде ДДҰ ұсыным беріледі. микобактериялар бактериологиялық әдіспен анықтау болжау мәні және бағаланған сандық бактериялық ағзадан шығаруға бар. туберкулез, ол молекулярлық-генетикалық зерттеу әдістері күресуге сенімдірек.

мәдениеттер

микобактериялардың Better анықтау мәдени зерттеулер мойындайды. Mordovsky, Финн II, LJ, және ұқсас: ол жұмыртқа ортаға жасалған патологиялық материал Егу. ғылыми-зерттеу мәдениет қолданбалы әдісі, егер дәрі-дәрмектер мен микобактерия және пробиркалар олардың отар бірқатар тиімділігін жанама дәлелі микобактериялардың қарсылық межелер. арттыру үшін патологиялық материалды микобактериялар егу оқшаулау пайыздық бірнеше орталарда өткізіледі.

грант және сұйықтар, соның ішінде көптеген мәдени, патогенді қажеттілігін қанағаттандыру. Бұл жүйеде пайдаланылатын және есепке алу түрі VANTES өсуін автоматтандырылған. Дақылдар жеті-сегіз аптаға дейін инкубация өткізілуге тиіс. Осы уақыт өсу болмауына өсімдік теріс деп санауға болады. ТБ өте сезімтал диагностикалық материалдық жұқтырып Гвинея шошқа,: Mycobacterium туберкулезбен анықтау ең тиімді жолы биологиялық үлгілерді қарастыру.

кейбір көрсеткіштер

жасырын инфекциясы - ПТР диагностика ашты зерттеу Қызықты өрісі, М. туберкулез зерттеу болды. ТБ инфекциясының қазіргі заманғы тұжырымдамасы, М. туберкулез байланыста болған жүз адамнан деп болжайды ақ жұқтырған болуы тоқсан-мүмкін, бірақ тек он олардың белсенді ауру әзірленуде жатыр. Басқа ТБ иммунитетi бар, және жағдайларды тоқсан пайызы, себебі инфекция жасырын қалады. бұл молекулярлық-генетикалық әдіс көмектесті үлгісін анықтау.

Генетика, оның дақылдар патологиялық материал теріс болған пайызы елу бес, және М. туберкулез жұқтырған адамдардың сексен пайызы, бірақ аурудың ешқандай радиографиялық көріністеріне ағып деп айтуға, ПТР оң жауап алды. Бұл генетикалық диагностикалық әдіс теріс болды, және субклиникалық инфекция М. туберкулез осы болды, олардың талдау (микроскопия және мәдениет) нәтижелерімен, ПТР зерттеулер тәуекел науқастарды анықтау үшін көмектесті.

Қазіргі заманғы ғылыми-зерттеу

Griess реагент арқылы сынақтан микобактериялардың нитраты редуктаза қызметі: Ресей Федерациясы және бактериологиялық зертханалар абсолютті шоғырлану жедел әдісін пайдаланыңыз. Туберкулезге қарсы орталықтар есірткі қарсылық анықтауға мүмкіндік береді әдісін пайдаланыңыз. сұйық ақпарат құралдарында осы егу, автоматтандырылған радиометриялық микобактериялардың флуоресцентті есепке алу жүйесі өсуі. Мұндай талдау тез жүзеге асырылады, - екі аптаға дейін.

Қазіргі уақытта, жаңа әдістері әзірленуде: микобактериялардың дәрітөзімділігі генотипті деңгейде өлшенеді. қарсылық гендердің молекулалық механизмдерін зерттеу және микобактерия қатысуын көрсетеді. Бұл гендер белгілі препараттарға төзімділігі байланысты. Мысалы, Kasa гендер, inhA изониазидке төзімді katG, rpoB гендік - рифампицин 16Sp РНК гендер және rpsL - сондықтан fluoroquinolone және - стрептомицин, emb1 - этамбутолға, Gyra.

мутациялар

қазіргі заманғы диагностика айтарлықтай ДНК зерттеу үшін молекулярлық-генетикалық деңгейдегі әдісін өсті және олардың барлық спектрінде мутацияның ауқымды зерттеулер жүргізу үшін мүмкіндік берді. Енді біз 516, 526 және 531 кодоны rpoB гендік ең көп таралған мутациялар екенін білеміз, және әр түрлі есірткі қарсылық анықталған. , Биохимиялық, биологиялық және мәдени, сондай-ақ кең қолданылатын заманауи молекулярлы-генетикалық әдістері - дәстүрлі әдістерін ғана емес, пайдаланып микобактериялардың типтеу әдістерінің тұтас ауқымы бар. Қазірдің өзінде бар барабар болып табылады және моногенді аурулардың ағымын болжау анықтау үшін дұрыс диагноз әдісін қамтамасыз етеді. Олар белгілі бір геннің дәл саласындағы ДНК зерттеулерге негізделген. Бұл әдетте күрделі процесс, уақыт тұтынатын және қымбат, бірақ молекулярлық-генетикалық талдау арқылы қамтамасыз етіледі деректер, әлдеқайда дәл және ақпараттық барлық басқа талдау деректер қарағанда.

Ол ұзақ ДНК ол odnakova кез келген ядролық жасушалар екендігін организмнің бүкіл өмір өзгерген жоқ екені белгілі болды, және осы онтогенезінің кез келген сатысында, дене мүлдем барлық жасушалар талдау қабылдауға мүмкіндік береді. зақымдалған Ген толық масштабты клиникалық ауру бірінші белгілері пайда дейін, сондай-ақ салауатты гетерозиготалы адамдар анықталған, бірақ генінің мутация бар болуы мүмкін. Молекулалық генетикалық тұқым қуалайтын ауру диагностикалық әдістері оның (тікелей тәсіл, ДНҚ-диагностика) ашу үшін, сондай-ақ тығыз бүлінген генінің (ДНК-диагностика, яғни, жанама тәсіл) байланысты маркер локусы ДНК (генетикалық полиморфизмдер), бар отбасында аурудың бөлуді талдауға мүмкіндік береді. Тікелей немесе жанама - кез келген ДНҚ-диагностикалау адам ДНҚ-ның қатаң анықталған бөлігін анықтау әдістері негізделген.

тікелей әдістері

ДНК диагностика тікелей әдістері кінәлілер гендік тұқым қуалайтын ауру белгілі кезде, сондай-ақ белгілі болып, және оның мутацияның түрлері. аурулардың бірқатар Мысалы, қолайлы тікелей әдістері. Бұл Хантингтон хорее (кеңейту ҚТГ--қайталанса), Фенилкетонурия (R408W), муковисцидоз (delF508, ірі мутациялар) және ұқсас. Тікелей әдісті негізгі артықшылығы толық меншігіндегі диагностикалық дәлдігі болып табылады, және отбасы қалған ДНК талдауын жасауға қажеті жоқ. тиісті гене мутация табылған болса, ол дәл қуалаудың, ауыртпалық отбасы демалыс үшін генотип анықтау диагноз бекіту мүмкіндік береді.

тікелей диагностика тағы бір артықшылығы аурудан қайтыс туыстары мен ата-аналар жаман мутацияның бір гетерозиготалы тасымалдаушысын анықтау болып саналады. аурулар рецессивных аутосомно үшін Бұл әсіресе дұрыс болып табылады. тікелей әдістерін Кемшіліктері, сондай-ақ қол жетімді. Оларды қолдану үшін, сіз дәл қалыптан тыс Ген, оның спектрін және оның мутацияның экзон-интрон құрылымын оқшаулау білу қажет. Емес, барлық моногенді аурулардың ағымын болжау бүгін мұндай ақпаратты алды. бір және сол гендік тұқым қуалайтын аурулардың дамуына себеп патологиялық мутация үлкен санын болуы мүмкін, себебі Ақпараттылық тікелей әдістері, толық қарастырылуы мүмкін емес.

жанама әдістері

ДНК диагностика Жанама әдістер зақымдалған Ген анықталған жоқ болса, басқа жағдайларда, барлық пайдаланылатын, бірақ тек chromosomally, немесе желісі диагноз нәтижені берген жоқ, егер гендік күрделі молекулалық ұйым немесе үлкен дәрежеде, егер көп болса (ол, орын жатыр патологиялық мутациялар). Жанама әдістер аллелей отбасында полиморфты маркерлер сегрегация талдау орындады. сол хромосомалық аймақта немесе локус табылған маркерлер тығыз ауруға байланысты мен жоюларды немесе грамматикалық бейнелейді, нүкте ауыстыру, қайталайды, және олардың полиморфизм блогында жасушалардың әр түрлі мөлшерде байланысты.

кеңінен адам геномының бөлінеді микросателлитті және minisatellite полиморфизмдер саналады жанама диагностика үшін ең ыңғайлы. нарығын және генінің арасындағы генетикалық қашықтық зақымдануы тым үлкен емес, егер олардың құны, жоғары ақпараттық мазмұны білдірді. Соңғы жағдайда, бағалау дәлдігі үлкен дәрежеде полиморфты нарығын және залал арасындағы рекомбинации жиілігі анықталады. Жанама диагностикалық әдістері, сондай-ақ алдын ала міндетті пациенттер мен мутацияның тасымалдаушылар арасында талданады халық зерттеу аллель жиіліктер қадам, плюс неравновесные және адгезиясы маркерлер мен мутант аллелей Рекомбинации ықтималдығын анықтау қажеттігін қамтамасыз етеді.

басқа да әдістері

РНҚ немесе ДНҚ қысқа сегменттері, сондай-ақ микроскопиялық зерттеу бойынша орналасуы бір геннің молекулярлық-генетикалық диагностика қажетті мутация анықтау үшін, сондықтан, болуы мүмкін емес. Онда «Адам геномының жобасы» болып табылады, сондай-ақ молекулалық генетика басқа аванстар айтарлықтай тұқым қуалайтын аурулардың диагностикасы мүмкіндігін кеңейтті - алдын ала және босанғаннан кейін екі. Бұл әдістер ерте анықтауды қамтамасыз ету және кімнің дебюттік ересек өтуде болжау poly- және моногенді аурулардың ағымын болжау, жасауға болады. Өкінішке орай, молекулярлық-генетикалық зерттеулер техникалық мүмкіндіктеріне байланысты диагностика жасөспірім мен бала болып табылады, әсіресе, кейде мұраға қатысты орнатылады этикалық шегінен.

Құрылымдық және сандық хромосомалық бұзылулар ауруы мен қатерлі ісік, және көптеген даму кемістіктерінің ең көп таралған себептері болып табылады. Хромосомалық аберрациялар отбасылық кеңес беру үшін маңызды болып табылатын, анықталуы қажет - болжамын бағалау үшін, болашақ жүктілік репродуктивті тәуекел бірге. Хромосома талдау генетикалық диагностика «алтын стандарты» болып табылады, бірақ ол шектелген. Тек әдістері молекулярлық-генетикалық талдау классикалық анықтау мүмкін емес болып табылады жіңішке хромосомалық өзгерістерді анықтау үшін олардың жоғары сезімталдық қабілетті негізінде флуоресцентті жапсырмалары клондау технология пайдаланылатын, себебі көп жасай аласыз цитогенетикалық зерттеулер. Бұл әдістер барған сайын көптеген басқа тұқым қуалайтын аурулармен, қарап біздің диагностикалық мүмкіндіктерін, даму мүмкіндігі шектеулі балаларды, ақыл-есі кеңеюде.

қорытындылар

Ол білім гендік құрылымы мен функциясы, өзгермелілігі түрлері, молекулалық генетика дамуына байланысты орын алған тұқым қуалайтын ауруларды анықтау қабілеті болды адамзат үшін өте маңызды болып табылады. оның әдістері ДНК молекуласының зерттеуге бағытталған - және ол қалыпты кезде, және ол зақымдалған кезде. нуклеотидтердің дезоксирибонуклеин қышқылының реттерін дайындау (ДНК) жеке фрагменттерін анықтау үшін сынамаларды алуға кезеңдерінде кеңейтеді. жасуша геномдық ДНҚ оқшаулау, шектеу фрагменттерінің (жыртып), күшейту (клондау), электрофорез (агарозном геле, олардың электр заряд және молекулалық салмағы бөліп). дискретті жолағы бетінде орналасқан нақты үзінділерді сәйкестендіру.

Содан кейін клондалған ДНҚ фрагменттері немесе синтетикалық радиоактивті зонд әрбір фрагменті гибридизация, олар арқылы өтетін акт арнайы сүзгілер, ішіне алу әрбір тест үлгідегі тең болады бақылау болып табылады. Егер сіз зонд салыстырғанда орнын немесе ұзындығы өзгертсеңіз, жаңа фрагменті немесе егер жоғалып, - барлық осы талданған гендік нуклеотидті кезекпен қайта құрылымдау ұшырады деп болжайды. секвенирования (ДНК ретпен анықтау), полимеразды тізбекті реакция (реттілігі санының артуы), праймеры белгілі гендердің дайындау, ДНК клондау, рекомбинантты молекулалар салдарынан рекомбинантты молекулалар алынған белоктар өндіру, толық жиынтығын құру (жинау: сегіз негізгі молекулярлық-генетикалық зерттеулер әдістері бар кітапхана) шектеу көмегімен алынған үзінділер клондалған.