Флуоресцентті микроскопия: әдісін принциптері

Сіңіру және жеңіл әрі қарай органикалық және бейорганикалық сұйықтар қайта шығарындылар фосфоресценции немесе флюоресценция нәтижесі болып табылады. құбылыстардың арасындағы айырмашылық жарық ағынының және сәуле жұту арасындағы интервал ұзақтығы болып табылады. Осы процестердің флуоресцентті, бір мезгілде дерлік, ал фосфоресценцию орын алған кезде - кейбір кешігіп.

тарихи ақпарат

1852 жылы, британдық ғалым Стокс, бірінші флуоресцентті сипатталған. Ол бар эксперименттер нәтижесінде жаңа термин енгізілді флюорит, ультракүлгін жарығында қызыл жарық шығарады. Стокс қызықты құбылысты атап өтті. Ол флуоресцентті сәуле толқын ұзындығы әрқашан қозу жарық ағыны артық деп табылды.

19-шы ғасырда гипотезаны растау үшін көптеген эксперименттер болды. Олар түрлі үлгілерін ультракүлгін жарық әсерінен флуоресценцияны екенін көрсетті. материалдардың арасында, басқалардың арасында, кристалдар, шайырлар, минералдар, хлорофилл, шикі есірткі, бейорганикалық қосылыстар, дәрумендер, майлар болды. биологиялық сынау үшін бояғыштар тікелей пайдалану 1930 жылы ғана басталды

Флуоресцентті микроскопия: сипаттамасы

20 ғасырдың зерттеулер бірінші жартысында пайдаланылатын материалдардың Кейбір жоғары ерекшелік қойылды. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Контраст әдістермен қол жеткізу мүмкін емес орындау, арқасында, флуоресцентті микроскопия әдісі биомедициналық және биологиялық зерттеулер маңызды құралы болды. Бірдей маңызды нәтижелер алынды, және материалдар үшін болды.

? флуоресценция микроскопия әдісі қандай артықшылықтары жасайды? жаңа материалдарды пайдалану мүмкіндігі және жоғары нақты ұялы submicroscopic компоненттерін таңдау айналды. Флуоресцентті микроскопия бір молекулаларды анықтай алады. Бояғыштар түрлілігі бір мезгілде бірнеше элементтерді анықтауға мүмкіндік береді. өз кезегінде, үлгідегі нақты қасиеттеріне байланысты, жабдықтың дифракционного шегі шектеулі кеңістіктік қарарында, қарамастан, осы деңгейден төмен молекулалардың сәйкестендіру, сондай-ақ әбден мүмкін. иррадиациялық экспонаты ПЕРЕВИВНОЙ кейін әр түрлі үлгілері. Бұл құбылыс кеңінен петрологии, ботаника, жартылай өткізгіш өнеркәсібінде пайдаланылады.

ерекшеліктері

жиі күрделі немесе тым әлсіз немесе өте күшті тәнсіз ПЕРЕВИВНОЙ жануар тіндерді немесе патогенді оқиды. Алайда, зерттеулерге мән нақты толқын ұзындығы қозғалады материалдық құрамдас енгізілуін алады және қажетті жарық ағыны қарқындылығы шығаратын. Флуорохромами дербес құрылымдар (көрінетін немесе көрінбейтін) қоса тiркелетiн қабілетті бояғыштар ретінде әрекет. Осылайша олар нысанаға жоғары селективті және кванттық бар.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Флуоресцентті микроскопия кеңінен табиғи және синтетикалық бояғыштар келуімен қолданылған. Олар эмиссия және қозудың белгілі қарқындылығы профильдер ие және нақты биологиялық мақсаттарға мақсатты.

жеке молекулалардың сәйкестендіру

Жиі, тамаша жағдайында, сіз жеке элементі жарқыл тіркеуге болады. Бұл үшін, басқалардың арасында, ол детектор және оптикалық фон жеткілікті төмен шу қамтамасыз ету қажет. салдарынан 300 мыңға дейін шығаратын болады photobleaching орындамауына флуоресцеина молекуласы. фотонды. процесінің 20% жинау тиімділігін және шамамен 60 мың көлемінде оларды тіркеуге болады.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. көшкін фотодиодам немесе электрондық көбейту негізінде флуоресцентті микроскопия, зерттеушілер екінші арқылы жеке молекулалардың мінез-байқауға мүмкіндік берді, ал кейбір жағдайларда тіпті минут.

күрделілігі

оптикалық шу фондық жолын кесу пайдасына негізгі мәселе. Арқасында Сүзгілер және линзалар жобалау пайдаланылатын материалдардың көптеген кейбір ПЕРЕВИВНОЙ танытуға, бұл шын мәнінде, ерте кезеңдерінде ғалымдардың күш төмен флуоресцен бар компоненттерін өндіру бағытталған. Алайда, кейінгі эксперименттер жаңа қорытындылар алып келді. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Атап айтқанда, ол жалпы ішкі рефлексия негізінде, бұл флуоресцентті микроскопия табылған, ол төмен фонды және жоғары қарқындылығы қоздыру жарық қол жеткізуге мүмкіндік береді.

механизм

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. жалпы ішкі рефлексия негізінде флуоресценция микроскопия принциптері, қысқа толқын немесе Қысқа пайдалану болып табылады. Ол әр түрлі БАҚ шекарасында орын сыну көрсеткіштерінің. Бұл жағдайда, жарық сәулелі призма арқылы өтеді. Ол жоғары сыну көрсеткіш параметр бар.

төмен параметрімен су ерітіндісін немесе шыны іргелес призма. жарық сәулелі астам маңызды болып табылады бұрышпен оған бағытталған болса, сəуле толығымен интерфейсінен көрсетіледі. Бұл құбылыс, өз кезегінде, толқындар nonpropagating туғызады. 200 нм кем қашықтықта үшін төменгі сыну параметрімен ортаға сіңіп Басқаша айтқанда, жинақталатын электромагниттік өріс.

Қысқа толқынды жарық қарқындылығы флюорофорлар қозғауға жеткілікті болар еді. Алайда, өйткені оның өте шағын тереңдігін, оның көлемі өте аз болады. нәтижесі төмен деңгейлі фон болып табылады.

түрлендіру

Флуоресцентті микроскопия жалпы ішкі көрінісі негізделген, EPI-жарықтандыру көмегімен жүзеге асырылуы мүмкін. Бұл жоғары сандық апертуралы (кем дегенде 1,4, бірақ ол 1.45-1.6 жетті жөн) және ішінара ұзағынан далалық аппаратурамен линзаларды талап етеді. Соңғы шағын спот мөлшерімен қол жеткізіледі. ағынының бір бөлігін арқылы бұғатталған жұқа сақина, пайдаланып үлкен біртектілігі. жалпы көрінісі бар, содан кейін сын бұрышын, үшін, біз линза тиелген орта және микроскоптың әйнектен сыну жоғары деңгейін қажет.